《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》

前 言

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 4789.10-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》和

GB/T 4789.37-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)》。

本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.10-2008 和GB/T4789.37-2008 相比，主要修改如下：

——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；

——修改了范圍；

——規(guī)范了樣品制備過程；

——增加了計(jì)算公式中系數(shù)1.1 的解釋；

——修改了附錄A 中胰酪胨大豆肉湯的名稱，規(guī)范為10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯；

——增加了第二法金黃色葡萄球菌 Baird-Parker 平板計(jì)數(shù)和第三法金黃色葡萄球菌MPN 計(jì)數(shù)。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C 是規(guī)范性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：

——GB 4789.10-84、GB 4789.10-1994、GB/T 4789.10-2003、GB/T 4789.10-2008。

——GB/T 4789.37-2008。

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)

1?范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn)；第二法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)；第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)。

2?設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1?恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃。

2.2?冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.3?恒溫水浴箱：37 ℃～65 ℃。

2.4?天平：感量0.1 g。

2.5?均質(zhì)器。

2.6?振蕩器。

2.7?無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。

2.8?無菌錐形瓶：容量100 mL、500 mL。

2.9?無菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。

2.10?注射器：0.5 mL。

2.11 pH?計(jì)或pH 比色管或精密pH 試紙。

3?培養(yǎng)基和試劑

3.1 10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯：見附錄A 中A.1。

3.2 7.5 %氯化鈉肉湯：見附錄A 中A.2。

3.3?血瓊脂平板：見附錄A 中A.3。

3.4 Baird-Parker?瓊脂平板：見附錄A 中A.4。

3.5?腦心浸出液肉湯(BHI) ：見附錄A 中A.5。

3.6?兔血漿：見附錄A 中A.6。

3.7?稀釋液：磷酸鹽緩沖液：見附錄A 中A.7。

3.8?營養(yǎng)瓊脂小斜面：見附錄A 中A.8。

3.9?革蘭氏染色液：見附錄A 中A.9。

3.10?無菌生理鹽水：見附錄A 中A.10。

第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)

4?檢驗(yàn)程序

金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)程序見圖1。

5?操作步驟

5.1?樣品的處理

稱取25 g樣品至盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000 r/min～10000 r/min 均質(zhì)1 min～2min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min～2 min。若樣品為液態(tài)，吸取25 mL 樣品至盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。

5.2?增菌和分離培養(yǎng)

5.2.1將上述樣品勻液于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴(yán)重時(shí)在10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長。

5.2.2將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。Baird-Parker平板36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h 或45 h～48 h。

5.2.3金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直徑為2 mm～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時(shí)為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。

5.3?鑒定

5.3.1染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5 μm～1 μm。

5.3.2血漿凝固酶試驗(yàn)：挑取、Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 個(gè)或以上，分別接種到5 mL BHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。

取新鮮配置兔血漿0.5 mL，放入小試管中，再加入BHI 培養(yǎng)物0.2 mL～0.3 mL，振蕩搖勻，置36℃±1 ℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6 h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～48 h，重復(fù)試驗(yàn)。

5.4?葡萄球菌腸毒素的檢驗(yàn)

可疑食物中毒樣品或產(chǎn)生葡萄球菌腸毒素的金黃色葡萄球菌菌株的鑒定，應(yīng)按附錄B檢測葡萄球菌腸毒素。

6?結(jié)果與報(bào)告

6.1?結(jié)果判定：符合5.2.3、5.3，可判定為金黃色葡萄球菌。

6.2?結(jié)果報(bào)告：在25 g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。

第二法 金黃色葡萄球菌 Baird-Parker平板計(jì)數(shù)

7?檢驗(yàn)程序

金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)程序見圖2。

8?操作步驟

8.1?樣品的稀釋

8.1.1固體和半固體樣品：稱取25 g樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000 r/min均質(zhì)1 min～2min，或置盛有225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2 min，制成1:10的樣品勻液。

8.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。

8.1.3用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL 稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1 mL 無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。

8.1.4按8.1.3 操作程序，制備10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1 次1 mL 無菌吸管或吸頭。

8.2?樣品的接種

根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2 個(gè)～3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10 倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL 樣品勻液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別加入三塊Baird-Parker 平板，然后用無菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

8.3?培養(yǎng)

8.3.1.1?在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36 ℃±1℃培養(yǎng)1h；等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)，45 h～48 h。

8.4?典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)

8.4.1金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直徑為2 mm～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。

8.4.2選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度3 個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在20 CFU～200 CFU 之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。如果：

a）只有一個(gè)稀釋度平板的菌落數(shù)在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

b） 最低稀釋度平板的菌落數(shù)小于20 CFU 且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

c）某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

d） 某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200 CFU 且有典型菌落，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落數(shù)不在20 CFU～200 CFU 之間，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；

以上按公式（1）計(jì)算。

e） 2 個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20 CFU～200 CFU 之間，按公式（2）計(jì)算。

8.4.3從典型菌落中任選5 個(gè)菌落（小于5 個(gè)全選），分別按5.3.2 做血漿凝固酶試驗(yàn)。

9?結(jié)果計(jì)算：

公式（1）：

T?=?AB/CD?………………………………………………………………… （1）

式中：

T——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)；

A——某一稀釋度典型菌落的總數(shù)；

B——某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；

C——某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)；

d——稀釋因子。

公式（2）：

T=(A1B1/C1+A2B2/C2)/1.1d………………………（2）

式中：

T?——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)；

A1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；

A2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；

B1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；

B2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；

C1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)；

C2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)；

1.1——計(jì)算系數(shù)；

d?——稀釋因子（第一稀釋度）。

10?結(jié)果與報(bào)告

根據(jù)Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌的典型菌落數(shù)，按9中公式計(jì)算，報(bào)告每g（mL）樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)，以CFU/g(mL)表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。

第三法 金黃色葡萄球菌MPN計(jì)數(shù)

11?檢驗(yàn)程序

金黃色葡萄球菌MPN計(jì)數(shù)程序見圖3。

12?操作步驟

12.1?樣品的稀釋

按8.1進(jìn)行。

12.2?接種和培養(yǎng)

12.2.1根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10 倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL 樣品勻液接種到10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯管，每個(gè)稀釋度接種3管，將上述接種物于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)45 h～48 h。

12.2.2用接種環(huán)從有細(xì)菌生長的各管中，移取1環(huán)，分別接種Baird-Parker平板，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)45 h～48 h。

12.3?典型菌落確認(rèn)

12.3.1見8.4.1。

12.3.2從典型菌落中至少挑取1 個(gè)菌落接種到BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂斜面，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，見5.3.2。

13?結(jié)果與報(bào)告

計(jì)算血漿凝固酶試驗(yàn)陽性菌落對(duì)應(yīng)的管數(shù)，查MPN 檢索表（見附錄C），報(bào)告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌的最可能數(shù)，以MPN/g（mL）表示。

附錄A ? （規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基和試劑

A.1 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯

A.1.1成分

胰酪胨（或胰蛋白胨）17.0 g

植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3.0 g

氯化鈉100.0 g

磷酸氫二鉀2.5 g

丙酮酸鈉10.0 g

葡萄糖2.5 g